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Cultiver les cellules de la rétine

Pouvoir étudier les cellules de la rétine une par une, examiner leur morphologie, leur biologie moléculaire, leurs interactions avec les cellules voisines, les effets de facteurs de croissance, de substances thérapeutiques… Ce vieux rêve des ophtalmologistes est devenu réalité il y a dix ans environ grâce à des techniques de culture cellulaire mises au point, entre autres, par des chercheurs de l’Institut de la Vision.

Pour comprendre les causes des pathologies de la vision et tester de nouveaux traitements, les modèles animaux porteurs de mutations et qui reproduisent de ce fait certaines formes de maladies humaines (de dégénérescences rétiniennes notamment) sont absolument indispensables. In vivo, en effet, des tests physiologiques fonctionnels non invasifs comme l’électrorétinogramme permettent de caractériser la pathologie, de suivre l’évolution de la rétine au cours de processus dégénératifs et d’évaluer l’action de nouvelles thérapeutiques. Cependant, il est tout aussi nécessaire et complémentaire de pouvoir décrypter ce qui se passe dans les cellules elles-mêmes, ainsi que leurs interactions avec d’autres cellules. C’est la fonction des « modèles cellulaires ».

Les chercheurs savent en effet maintenir vivantes des rétines entières dans des milieux de culture, sans altérer leur structure. Ils savent aussi sauvegarder in vitro des neurones fonctionnels isolés à partir de rétines adultes humaines prélévées post-mortem ou de rétines de rongeurs ou de porc.

Pendant des décennies, seules les cellules rétiniennes de rats et de souris nouveau-nés ou d’embryons pouvaient être mises en culture, explique Valérie Fradot, responsable de la plate-forme de culture cellulaire à l’Institut de la vision. On considérait que les neurones adultes ne pouvaient survivre in vitro et que les neurones de la rétine ne devaient pas faire exception.

Mais en 1988, le groupe de Seung Kim et Hiroshi Takahashi (University of British Columbia, Vancouver) parvient à maintenir in vitro des explants de rétine humaine adulte prélevée post-mortem, une première mondiale pour un tissu du système nerveux central. En 1990, Yves Courtois et David Hicks, à Paris, réussissent à cultiver des cellules gliales de Müller et des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Quelques années plus tard, en 1996, l’équipe de José-Alain Sahel, Henri Dreyfus et David Hicks, à Strasbourg, arrive à séparer la couche de photorécepteurs des autres couches cellulaires de la rétine grâce à une technique de coupe dans l’épaisseur du tissu. Mieux, les chercheurs font subsister en milieu de culture des photorécepteurs humains issus de rétines prélevées post-mortem, ainsi que des photorécepteurs de rat et de porc. Ces cellules ne survivaient cependant qu’en présence d’autres types cellulaires, les cellules gliales. En 1998, la même équipe fait un nouveau pas en avant en maintenant in vitro des photorécepteurs isolés et parfaitement fonctionnels pendant une semaine.

Depuis, il est devenu possible de cultiver les différentes types cellulaires de la rétine : cellules gliales de Müller, cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, photorécepteurs (cônes et bâtonnets), mais aussi cellules bipolaires et horizontales, cellules ganglionnaires et cellules souches de la marge ciliaire (voir l’article sur ce thème). Ces divers modèles de cultures primaires, chez l’animal, peuvent alors servir à toutes sortes de techniques d’étude (électrophysiologie, tests de survie, marquage par anticorps, etc.) et peuvent également être génétiquement modifiées à l’aide de techniques comme l’électroporation (on applique un choc électrique de haut potentiel sur la membrane des cellules). Toutes ces opérations sont effectuées en salle blanche protégée, avec air filtré et hottes à flux laminaire pour éviter toute contamination des cultures, maintenues en survie dans des incubateurs à 37°C.

Les protocoles de culture sont aujourd’hui parfaitement rodés. Une première méthode consiste à réaggréger des cellules qui ont été dissociées les unes des autres. La rétine est prélevée, digérée par des enzymes puis les cellules isolées sont mises en culture dans un milieu nutritif approprié. Elles ont alors tendance à se fixer au support sauf si on les soumet à une centrifugation, auquel cas elles forment des sphères constituées de plusieurs couches cellulaires, ce qui permet d’étudier leurs interactions et leur devenir (leur différenciation). On peut aussi faire en sorte que les cellules restent dissociées ; elles sont alors cultivées en monocouche de cultures mixtes (tous les types cellulaires sont présents). Des techniques sophistiquées permettent également de purifier un seul type de cellule rétinienne, notamment les cellules ganglionnaires, pour les étudier individuellement. Une deuxième méthode, la culture d’explants, vise à préserver autant que possible la structure de la rétine dans ses trois dimensions. On prélève alors tout ou partie de la rétine et on la maintient à plat sur une membrane spécifique laissant diffuser un milieu de culture adéquat.

Pour s’affranchir des prélèvements sur des animaux, des chercheurs ont également développé les cultures de cellules rétiniennes immortelles (lignées cellulaires), issues de cancers de la rétine ou rétinoblastomes. Stockées au froid pendant des années ces cellules peuvent être utilisées à la demande.

La technologie de culture rétinienne, on l’aura compris, est cruciale pour le développement des recherches thérapeutiques. Même si une culture in vitro en deux ou en trois dimensions ne peut pas reproduire la complexité et le fonctionnement de la rétine in vivo, elle s’en rapproche. C’est un moyen rapide et relativement peu coûteux d’analyse des effets fonctionnels d’une mutation génétique, des mécanismes moléculaires à l’œuvre dans une pathologie rétinienne et des modes d’action des thérapies expérimentales, sans lequel la recherche sur les maladies de la rétine ne pourrait convenablement progresser.